细胞内ELISA（也称为基于细胞的ELISA、细胞蛋白质印迹或细胞印迹）是一种使用比色或荧光读数对培养细胞进行定量的广为接受的免疫细胞化学测定方法，用于量化培养细胞中的靶蛋白或靶蛋白的翻译后修饰。
这里我们提供了96孔微孔板的通用方案。大致流程包括：培养细胞（根据需要进行处理）并将其接种到包被的96孔微孔板中；固定和透化后，将一抗添加到孔中并孵育，然后添加标记的二抗，最后进行检测和分析。
一、准备细胞
粘附细胞可以在推荐的分析微孔板中生长，或直接接种到分析微孔板中并允许其附着贴壁几个小时或过夜。
所需材料
- 96孔微孔板：底部透明
（续写内容）
二、固定与透化处理
固定步骤需在细胞贴壁完成后进行。建议使用4%多聚甲醛室温固定15分钟，随后用PBS轻柔洗涤3次。透化处理可选用0.1% Triton X-100或0.5% Tween-20溶液，作用5分钟以增加细胞膜通透性，便于抗体渗透。注意透化时间过长可能导致蛋白流失，需根据目标蛋白的亚细胞定位优化条件。
三、抗体孵育与信号放大
1.封闭：每孔加入200 μL含5% BSA的PBS，室温封闭1小时，减少非特异性结合。
2. 一抗孵育：稀释一抗于封闭液中（建议参考抗体说明书优化浓度），每孔加入100 μL，4℃过夜或室温孵育2小时。若检测磷酸化蛋白，需在裂解缓冲液中添加磷酸酶抑制剂。
3. 二抗标记：洗涤后加入HRP或荧光标记的二抗（避光操作），室温孵育1小时。为增强信号，可选用生物素-链霉亲和素放大系统。
四、检测与数据分析
1. 比色法：加入TMB底物显色10分钟，2M H₂SO₄终止反应，450 nm波长读取吸光度。
2. 荧光法：若使用荧光二抗，直接通过酶标仪检测对应波长（如FITC: 488/520 nm）。
3. 标准化：建议同时设置β-actin或GAPDH内参孔，数据以目标蛋白/内参比值呈现。
注意事项
- 细胞密度需控制在70%-90%汇合，过高易导致信号饱和。
- 每步洗涤需彻底（3×5分钟），避免残留试剂干扰。
- 对于弱表达蛋白，可延长一抗孵育时间或提高二抗灵敏度。