小鼠原代肝细胞分离提取技术的成功实施，关键在于后续的细胞培养与功能维持环节。在完成肝脏灌注消化后，需立即将细胞悬液置于预冷的完全培养基中，以4℃低温离心（50-100g，3分钟）去除非实质细胞碎片。此时采用90%高糖DMEM配合10%胎牛血清的双抗培养基，可显著提高细胞贴壁率。
小鼠原代肝细胞分离提取是肝脏相关研究的重要基础技术，其关键在于保证细胞活性和功能完整性。以下为技术流程的后续关键步骤及注意事项：
梯度离心纯化
将消化后的细胞悬液经70μm滤网过滤后，采用25%-50%的Percoll密度梯度离心（800g，10分钟，4℃），可有效去除红细胞和细胞碎片。离心后可见明显分层，肝细胞主要分布于中层乳白色环带，用巴氏管小心吸取目标层细胞，以预冷的PBS洗涤2次。此步骤需严格控制离心速度，过度离心会导致细胞膜损伤。
台盼蓝活性检测
将重悬的细胞与0.4%台盼蓝溶液按1:1混合，3分钟内用血球计数板计数。优质制备的肝细胞存活率应＞85%，若低于此值，需检查胶原酶批号有效性或缩短消化时间。值得注意的是，冬季操作时应将染液预热至37℃，避免温度骤变影响染色效果。
差速贴壁纯化
将细胞接种于经0.1%明胶预处理的培养皿中，37℃培养30分钟后，未贴壁的肝细胞可被轻轻吹打收集。此方法能有效去除库普弗细胞等杂质，但需严格控制时间，过久贴壁会导致肝细胞活性下降。建议使用含10%FBS的Williams E培养基维持细胞功能。
冻存与复苏要点
采用分阶段降温法：4℃平衡30分钟→-20℃2小时→液氮气相过夜后浸入。复苏时需快速37℃水浴震荡，离心后建议使用含5mM NAC的培养基，可显著降低氧化应激损伤。实验显示经冻存的肝细胞在3小时内完成接种时，其白蛋白分泌能力可保持新鲜细胞的82%±6%。
该技术需特别注意胶原酶IV的活性验证，建议每批次进行小样测试。操作全程保持低温环境（除消化步骤外），使用经肝素处理的器械可有效防止细胞聚团。成功的原代肝细胞培养在倒置显微镜下应呈现典型的多边形形态，48小时内可见清晰的胆小管网络形成。
为获得高纯度肝细胞，可采用percoll密度梯度离心法（25%-50%梯度），该方法能有效分离红细胞和库普弗细胞。值得注意的是，新鲜分离的肝细胞在培养6小时后会出现首次凋亡高峰，建议在培养皿表面预先包被Ⅰ型胶原（0.1mg/cm²），通过模拟细胞外基质环境延缓去分化进程。
在功能验证阶段，建议采用吲哚菁绿（ICG）摄取实验评估细胞代谢活性，功能性肝细胞会在培养24小时内特异性摄取并分解该染料。同时，尿素合成速率（每106细胞每日≥20μg）和albumin分泌量（＞5μg/mL/24h）是评价细胞质量的核心指标。对于需要长期培养的实验，可尝试添加10mM烟酰胺和0.1μM地塞米松，这两种成分能协同维持CYP450酶系的表达水平。