在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加酶结合物和显色剂后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)，有人称之为孵育。
ELISA实验中常用的温育方式是温箱法和水浴法。温箱法能够提供更精确和稳定的温度控制，并且可以避免交叉污染，因此是ELISA实验中最常用的温育方式。水浴法可以有效减少“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深的情况，但操作时需要注意避免交叉污染。建议使用合适的架子将ELISA板架在水面上，而不是直接接触水面或让其漂浮在水面上。一些特殊情况下可能使用其他温育方式，但需要仔细评估其对实验结果的影响，并且一般不建议使用微波辐射法进行温育，因为它可能对一些抗体和酶造成损害。无论使用哪种温育方式，都应确保温育温度的稳定性和均匀性，并严格按照试剂盒说明书进行操作。在ELISA实验中，除了温育方式的选择外，温育时间同样至关重要。不同的试剂盒对温育时间的要求可能有所差异，但通常建议在37℃下温育30-60分钟。温育时间过短可能导致抗原抗体结合不充分，影响检测灵敏度；而温育时间过长则可能增加非特异性结合的风险，导致背景值升高。
此外，温育过程中的湿度控制也不容忽视。尤其是在使用温箱法时，若环境湿度过低，可能导致反应孔内液体蒸发，从而影响反应体系的稳定性。为避免这一问题，可在温箱内放置装有蒸馏水的托盘，以维持适宜的湿度水平。
对于需要长时间温育的实验，建议在温育过程中定期检查温箱或水浴锅的温度稳定性，并使用校准过的温度计进行验证。若发现温度波动较大，应及时调整或更换设备，以确保实验结果的可靠性。
最后，温育结束后的操作同样关键。在取出ELISA板时，应避免剧烈震动或倾斜，以防液体溅出或混合。同时，需按照试剂盒说明书的要求，迅速进行后续的洗涤和显色步骤，以确保实验流程的连续性和准确性。
通过合理选择温育方式、严格控制温育条件，并遵循标准化的操作流程，可以有效提升ELISA实验的重复性和准确性，为科研和临床检测提供可靠的数据支持。