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牛棒杆菌探针法荧光定量PCR 试剂盒
【产品名称】牛棒杆菌探针法荧光定量PCR 试剂盒
Name ：Corynebacterium Bovis Probe qPCR Kit
【包装规格】50次/盒
【预期用途】牛棒状杆菌病(Bovine Corynebacteriosis)是指由棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)的某些细菌引起的膀胱炎和肾盂肾炎。临床主要特征为频尿、浊尿、血尿和发热。该病主要见于成年母牛，多在妊娠期和产后发病。本病分布于世界各地。因此快速灵敏检测牛棒杆菌具有重要意义。本产品就是为此目的根据 PCR 原理开发的试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。
2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据牛棒杆菌高度保守区设计，不会跟其他细菌的 DNA 发生交叉反应。
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。
6. 本产品只能用于科研。
【规格及成分】
成分 | 包装 |
2×Probe qPCR MagicMix | 500 μL（本色盖） |
荧光PCR 专用模板稀释液 | 1 mL（黄盖） |
牛棒杆菌探针法qPCR 引物混 合液 | 100 μL（白盖） |
牛棒杆菌qPCR 探针 | 50 μL（棕色管） |
牛棒杆菌探针法qPCR 阳性对照 (1×10E8 拷贝/μL) | 50 μL（黄盖） |
使用手册 | 1份 |
【运输及保存】低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。
【自备试剂】样品DNA。
【使用方法】一、稀释标准曲线样品（以10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。 由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震 荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品DNA 的制备
7. 如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性 对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为 NC。
8. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式细菌DNAout。本试剂盒免费赠送 20次免DNA 提取的核酸释放剂，本产品的裂解液可以直接作为 PCR 模板，省略 了 DNA 提取步骤。
三、、Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
成分/每管
| 样品管 N+2 个 | RT-PCR 阴性对照 | 标准曲线样品管 （1-6 管） |
2×Probe qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
牛棒杆菌 qPCR 探针 | 1 μL | 1 μL | 1 μL |
牛棒杆菌探针法 qPCR 引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 2 μL |
N+2 个待测 DNA 模板 | 7 μL | - | - |
超纯水 | - | 7 μL | - |
第 7 步所得标准曲线样品稀释液（2-7 号） | - | - | 各 7 μL（2 号样到2 号管，3 号样到 3 号管…） |
11.盖上盖子后上机，按面参数进行 RT-PCR：
过程 | 温度 | 时间 |
预变性 | 95℃ | 5 min |
PCR 反应 （40 个循环） | 95℃ | 15sec |
60℃ | 60sec（采集 FAM 通道的荧光信号） |
四、数据处理
12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。
