尽管体外生物化学激酶分析(如典型的三明治ELISA)常用于假说检验和药物筛选，但它们无法复制细胞内的环境。分析完整细胞内的蛋白磷酸化也许能更准确地代表特定信号通路网络的状态。一些免疫分析最近被开发出来，能够在完整细胞的背景下测定蛋白磷酸化。细胞在同一个孔中被刺激、固定和阻断。使用磷酸化特异抗体，利用荧光或显色检测系统来评估磷酸化状态。此外，在微孔板的同一个孔中同时检测磷酸化蛋白和总蛋白。因此，来自目的蛋白的信号可通过第二种蛋白来标准化，校正各孔之间的差异，实现磷酸化蛋白水平的准确评估，并比较多个样品，与传统免疫印迹中使用磷酸化特异和总蛋白抗体相似。这些分析绕过了制备细胞裂解液的需要，因此更适合高通量分析。基于细胞的ELISA技术不仅简化了实验流程，还为信号通路研究提供了更接近生理状态的数据。这种方法的创新之处在于，它巧妙地将细胞刺激、固定与检测整合在同一个微孔中，最大限度地保留了蛋白质的天然构象和相互作用网络。
实验过程中，细胞的固定尤为关键，既要确保磷酸化位点的充分暴露，又要避免过度交联导致抗体无法识别表位。研究人员发现，温和的多聚甲醛固定结合透膜处理，能够在保持细胞结构完整性的同时，允许抗体高效结合目标蛋白。此外，阻断步骤的优化也显著降低了背景信号——使用含5%BSA和0.1%Tween-20的缓冲液，能有效减少非特异性结合，提高信噪比。
在数据分析方面，双抗体检测系统（磷酸化抗体与总蛋白抗体）的同步应用，使得结果标准化更为精准。通过计算磷酸化信号与总蛋白信号的比值，可以消除细胞数量差异、孔间加样误差等变量干扰。这种内参校正方式，尤其适用于药物梯度实验或时间序列研究，例如观察激酶抑制剂在不同浓度下对信号通路的动态影响。