一、抗体选择与验证问题
特异性不足：需明确目标蛋白的亚型、修饰状态及识别表位，优先选择经过WB验证的抗体（如CST、Abcam等品牌），并查阅独立文献验证。
种属匹配错误：确保抗体说明书标注的种属反应性与实验样本一致（如人、小鼠等）。
二、样本处理与保存问题
样本降解：组织样本需及时固定（离体2小时内），裂解液需含蛋白酶/磷酸酶抑制剂，避免反复冻融。
定量偏差：采用BCA法或Bradford法时需注意去污剂干扰，建议分装保存以减少冻融影响。
三、实验操作优化
抗体浓度与孵育：避免盲目提高浓度，需通过预实验优化稀释比例（如WB常用1:1000），4℃过夜孵育可增强特异性结合。
封闭不充分：更换封闭液品牌（如BSA或脱脂牛奶）或延长封闭时间，降低非特异性结合。
四、信号检测与背景控制
高背景：检查二抗浓度是否过高，优化洗涤条件（如增加洗涤次数或调整冲击力）。
条带模糊/缺失：验证转膜条件（电流、时间）及抗体效价，使用阳性对照确认蛋白表达。
五、抗体保存与使用误区
反复冻融：分装保存（建议≥10μL/管），避免效价降低；即用型抗体需4℃保存，长期不用建议-80℃。
回收利用风险：稀释后抗体缓冲体系易变化，推荐现配现用，尤其对效价敏感的抗体。
通过严格遵循上述步骤，可显著降低抗体实验误差，提高结果可靠性。