在完成小鼠原代破骨细胞分离与培养后，后续实验操作的规范性直接影响结果的可靠性。以下关键注意事项需特别关注：
1. 诱导分化阶段的动态监测
分化诱导第3天起需每日观察细胞形态变化。典型破骨细胞前体细胞会呈现不规则梭形，随着分化进程逐渐融合为多核巨细胞。建议采用倒置显微镜记录同一视野的时间序列变化，避免频繁移动培养皿导致细胞脱落。若72小时后仍未出现融合趋势，需排查诱导剂（如RANKL）活性或细胞接种密度是否适宜。
2. 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色的时机控制
染色过早会导致阳性信号弱，过晚则可能因细胞凋亡出现假阴性。最佳窗口期为诱导后5-7天，当镜下可见明显多核细胞（≥3个细胞核）时进行。注意固定液（4%多聚甲醛）需预冷至4℃，固定时间严格控制在10分钟内，避免抗原表位破坏。
3. 功能实验的干扰因素排除
• 骨吸收实验需提前用0.1M NaOH处理骨片30分钟去除内源性蛋白
• 采用六孔板培养时，每孔应加入2mL新鲜培养基维持pH稳定
• 细胞计数建议使用台盼蓝与乙酸（1:1）混合液，可有效区分破骨细胞与前体细胞
4. 冻存复苏的特殊处理
破骨细胞冻存需采用程序降温法（-1℃/分钟），复苏后应直接接种于预铺胶原蛋白的培养板。值得注意的是，复苏细胞骨吸收活性会降低30-40%，建议仅用于基因检测等终端实验。
实验结束后，所有接触过破骨细胞的耗材需经10%次氯酸钠浸泡灭菌，避免具有活性的蛋白水解酶污染其他实验体系。建议设立诱导剂阴性对照组和RAW264.7细胞阳性对照组，双验证实验系统的敏感性。